Metodi per l'analisi dei chelati

L'esigenza di disporre di metodi precisi e riproducibili per l'analisi del contenuto di comlessi/chelati metallici nei prodotti commerciali è emersa fin dall'inizio della loro introduzione sul mercato.
I metodi non sono gli stessi per tutte le categorie di complessi/chelati in quanto dipendono dalla natura sia del metallo, sia della parte organica chelante. Inoltre variano a seconda che si tratti di di specie molecolari con formula ben definita o di miscele di specie complesse/chelate, quali i "proteinati".
Nel gennaio 1994, Brown e Zeringue riportarono il primo lavoro nella letteratura tecnica dell'industria mangimistica con lo scopo di indagare la solubilità e la struttura dei chelati. I due ricercatori esaminarono 15 differenti prodotti minerali (chelati, complessi e proteinati di Cu, Zn e Mn), determinarono la solubilità del metallo presente nei prodotti in tamponi a pH diversi (pH 5 e pH 2) e indagarono sulle relazioni strutturali tra il metallo solubile ed il ligando tramite la cromatografia per gel filtrazione. Sebbene interessante, la tecnica ebbe scarsa applicazione a causa della richiesta di apparati cromatografici non utilizzati nei mangimifici.
Nell'ottobre dello stesso anno Parks e Harmston pubblicarono un metodo che utilizzava strumentazione più semplice ed economica, ma di limitata utilità. I due autori cercarono di determinare il grado di associazione tra il minerale ed il ligando organico poiché ritenevano che l'associazione ligando-minerale fosse indicativa della biodisponibilità del minerale nell'apparato digerente del bestiame e del pollame. Utilizzarono proteinati di rame estratti con acqua distillata. Il filtrato ed il residuo ottenuti vennero testati per il contenuto di rame tramite assorbimento atomico e per il contenuto proteico tramite il metodo di Kjeldahl. Poiché l'assorbimento atomico non può distinguere tra rame complessato o in forma ionica, il filtrato fu anche testato con un indicatore specifico per il rame (Quantofix) che misura solo la forma ionica in soluzione. Dai dati di solubilità fu possibile calcolare la costante di stabilità (Rf): Rf= (percentuale di rame proteinato nel residuo)/[(percentuale rame in forma ionica nel filtrato)+(proteina solubile come percentuale sulla proteina totale)].
Nel 1997 Leach e Patton, riprendendo i due lavori citati precedentemente, proposero un metodo semplice per valutare i minerali chelati che apportava come novità l'utilizzo di un elettrodo ione-selettivo per discriminare il metallo libero da quello complessato in soluzione.
Holwerda nel 2001 propose un metodo che permette di stimare, in prodotti contenenti rame e zinco, i metalli complessati in soluzione acquosa basandosi su una semplice reazione colorimetrica che fa uso di un sale indicatore: il trietilammonio cloroanilato (TEAC), facilmente sintetizzabile in laboratorio. Il metallo libero in soluzione acquosa si combina con il cloroanilato per dare polimeri di coordinazione insolubili di colore verde. Questo metodo fornisce una stima semiquantitativa delle quantità relative di metallo libero (rame e zinco), complessato/chelato nei vari prodotti commerciali.
Pastore et al. nel 1999 proposero un rigoroso approccio multistrumentale per l'analisi dei chelati con i lisati proteici (proteinati) basato soprattutto sulla cromatografia "size exclusion" e su misure di dicroismo circolare.
E' stato osservato che la chelazione è tanto più efficace quanto più l'idrolisi della proteina è avanzata verso formazione di amminoacidi liberi. Nel caso di idrolisi incompleta anche la chelazione è incompleta e in tal caso gran parte del metallo è presente come sale inorganico sotto forma di grani ben visibili al microscopio e riconoscibili con la spettrometria FT-IR. Al riguardo un'indagine preliminare macro- e micro-morfologica è raccomandabile che sia sempre effettuata.
Con la direttiva europea 70/524/CEE, l'Unione Europea ha fornito una lista di integratori autorizzati per l'alimentazione animale tra i quali si trovano anche i chelati metallici di amminoacidi derivanti da proteine di soia idrolizzate.
Al riguardo, un metodo presentato in un brevetto del 2003 permette di stabilire se un campione incontra le rigide specificazioni della direttiva europea sopraccitata, ossia se i chelati abbiano un peso molecolare inferiore ai 1500 Da e se il prodotto derivi dalle proteine della soia. Il metodo prevede l'utilizzo dell'ultrafiltrazione per separare i chelati metallici. La procedura prevede che il campione venga dissolto in acqua o in una soluzione moderatamente acida; la soluzione deve essere filtrata con una prima membrana con un cutoff tra i 100.000 ed i 500.000 Da, per rimuovere le grosse molecole e le sostanze insolubili tra cui il supporto inerte. Il primo ultrafiltrato ottenuto viene sottoposto ad una seconda filtrazione con una membrana avente cutoff tra 1.500 e 3.000 Da, fornendo un secondo ultrafiltrato. Ad ogni passaggio, inoltre, viene misurato il contenuto di metallo. Il secondo ultrafiltrato viene infine analizzato per il contenuto totale di amminoacidi ed il contenuto totale di amminoacidi liberi i cui profili devono essere simili a quello delle proteine della soia.